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電泳后,核酸需經(jīng)染色才能顯色出帶型,常用以下核酸染色劑:
1、溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)最常用的核酸熒光染料,可嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間,在紫外線激發(fā)下,發(fā)出桔紅色熒光。EB-DNA復合物中的EB發(fā)出的熒光,比游離的凝膠中的EB發(fā)出的熒光強度大10倍,因此無需洗凈背景即可清楚觀察核酸帶型。若EB背景太深,可將凝膠浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/LMgCl2中5min,使非結(jié)合的EB褪色,這樣可檢查到10ng的DNA樣品,EB也可用于檢測單鏈DNA或RNA,但其對單鏈核酸的親和力相對較小,熒光產(chǎn)率也相對較低。在凝膠或電泳緩沖液中加入終濃度為0。5μg/ml的EB,染色可在電泳過程中進行,能隨時觀察核酸的遷移情況。但EB帶正電荷,嵌入堿基后增加了核酸分子的剛性,使遷移率減慢,故不宜用于測定核酸分子量的大小,這時應在電泳后將凝膠浸入0。5μg/ml的EB水溶液中10min進行染色。EB見光易分解,應于4℃避光保存
2、吖啶橙(acridineorange,AO):吖啶橙可嵌入雙鏈核酸堿基對之間,在254nm紫外線激發(fā)下發(fā)出530nm的綠色熒光;還通過靜電與單鏈核酸的磷酸基結(jié)合,在254nm紫外線激發(fā)下產(chǎn)生640nm的紅色熒光。因此可區(qū)分單鏈和雙鏈核酸,靈敏度分別為0。1μg和0。05μg。但吖啶橙的染色操作要求嚴格,應在22℃,0。01mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7。0)中避光浸泡30min,然后在搪瓷盤中用該緩沖劑4℃脫色過夜或22℃脫色1~2小時
3、銀(Ag+)試劑:Ag+與核酸形成穩(wěn)定復合物,然后用甲醛使Ag+還原成銀顆粒。AgNO3等試劑可使聚丙烯酰胺凝膠上的單鏈,雙鏈DNA及RNA都染成黑褐色。銀染法的靈敏度比EB染色高200倍左右,比亞甲藍染色高100~1000倍,在小于0。5mm厚的凝膠中,能檢測出0。5ng的RNA,其缺點是專一性不強,能與蛋白質(zhì),去污劑反應也產(chǎn)生褐色,而且對DNA的染色定量不準確。銀與DNA穩(wěn)青秀合,對DNA有破壞作用,不適于DNA片段回收的制備
4、亞甲藍(methyleneblue)可將RNA染成藍色,但靈敏度不高,而且操作時間長。染色過程:膠浸泡于0。02%的亞甲藍,10mmol/LTris-Ac(pH8。3),4℃放置1~2h,用凈水洗5~8h(反復換水),帶型肉眼可見,最低檢測量為250ng
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